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]構建玉米誘變變體庫，創(chuàng)制玉米新種質(zhì)資源。[方法]采用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變玉米優(yōu)良自交系B73和鄭58，構建變體庫；選取小葉夾角突變體rla1、rla2進行密植產(chǎn)量測定和遺傳學分析。[結果]2個突變體庫的M2代含有表型豐富的突變體，尤其是一些突變體表現(xiàn)出優(yōu)良農(nóng)藝性狀，如葉夾角小、棕色葉中脈、矮化、抗性，具有重要的育種價值。rla1、rla2表型相似，較初始材料耐密植，在試驗各種植密度下，單位面積產(chǎn)量均高于對照組；且產(chǎn)量隨著密度增大而提高，其最大密植度在100 000株/hm2。遺傳學分析顯示，rla1、rla2都是單基因隱性突變，而且是等位基因突變。[結論]B73和鄭58的EMS突變體庫為玉米育種提供了寶貴的材料資源。
關鍵詞 甲基磺酸乙酯；突變體庫；種質(zhì)資源；葉夾角
中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）11-03162-04
Abstract [Objective] The aim was to construct mutant libraries of maize and create new maize germplasm resources. [Method] Mutant libraries of maize inbred B73 and Zheng 58 were constructed by EMS mutagenesis. Measurement the yield under high density and genetic analysis of rla1 and rla2 was carried out. [Result] The M2 generation contained various phenotypes of mutants. Above all， some mutants showed excellent agronomic traits， such as small leaf angle， brown leaf midrib， dwarfism and resistance， which were very valuable in maize breeding. The narrow leaf angle mutants rla1 and rla2 had similar phenotype， and allowed higher planting densities than the wild type line. Under different planting densities in this study， the yields of rla1 and rla2 per unit area were higher than control， and increased as the increase of planting density， whose proper maximum density would be more than 100 000 plants per hectare. The results of genetics analysis indicated that the mutant phenotype of rla1 and rla2 was caused by recessive mutation in a single locus， and rla1 and rla2 were two alleles of the same gene. [Conclusion] The EMS mutant libraries of B73 and Zheng 58 provided valuable germplasm resources for maize breeding.
Key words Ethyl methane sulfonate； Mutant library； Germplasm resource； Leaf angle
玉米是食用和能源兩用作物，是目前世界上應用價值最高的作物之一，自2012年已成為我國第一大糧食作物。培育優(yōu)良品種，提高玉米產(chǎn)量，對滿足我國糧食、食品、能源需求具有重要意義。當前我國玉米生產(chǎn)和育種所依賴的種質(zhì)基礎僅局限于3～4個種群中的數(shù)個骨干自交系，生產(chǎn)用種質(zhì)的遺傳脆弱性和創(chuàng)新能力不足成為選育突破性新品種的瓶頸。玉米種質(zhì)資源的創(chuàng)新，對拓寬我國玉米種質(zhì)的遺傳基礎具有重要理論價值和現(xiàn)實意義。傳統(tǒng)育種技術選擇效率低、周期長，不能滿足當前玉米生產(chǎn)對優(yōu)良品種的需求?；瘜W誘變可以提高突變頻率，加快新種質(zhì)的創(chuàng)制速度。
甲基磺酸乙酯（EMS，ethyl methane sulfonate）是一種高效誘變劑，誘變頻率高，突變位點在基因組中分布均勻，對基因組傷害小，優(yōu)良的突變體材料可以直接用于育種[1-2]。1978年Neuffer用EMS的石蠟油溶液誘變玉米花粉并獲得成功，之后Garst Seed Co.用EMS處理玉米自交系花粉獲得了抗除草劑突變體[3]，美國ICI公司從玉米EMS誘變?nèi)后w中先后篩選到抗除草劑Pursuit突變體、糯質(zhì)突變體和甜質(zhì)突變體[4]。Allen Wright從EMS誘變的B73 M3后代中分別篩選到高油、高亞油酸、高賴氨酸、高蛋白、高油酸和低棕櫚酸突變株。Victor Roboy也從玉米EMS誘變后代中篩出了高油突變體[4]。國內(nèi)外研究表明，EMS誘變玉米花粉可以產(chǎn)生豐富的種質(zhì)資源，而且到目前為止EMS誘變是玉米突變體創(chuàng)制最成功的方法。試驗用EMS誘變B73和鄭58花粉，分別建立B73和鄭58的突變體庫，在突變體庫中篩選表型豐富的突變體，以期為后期的育種實踐提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料 試驗誘變親本為玉米自交系B73和鄭58，均為實驗室培育；誘變劑甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）與載體劑輕質(zhì)石蠟油，均購自sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 EMS誘變處理[5]。參照Neuffer的方法來配制EMS石蠟油溶液，并誘變B73、鄭58花粉。在通風櫥內(nèi)將EMS和石蠟油按1∶100（V/V）配成1%母液，然后用攪拌器攪拌1 h。選擇生長良好的植株，在雌穗吐絲前套袋，待花絲長出適當長度即可用于誘變處理。誘變處理前1 d下午用雜交袋套好雄穗，將1% EMS母液用石蠟油稀釋至0.067% 的工作液。處理當天上午在露水退去后，收集新鮮花粉，篩子過濾后，將花粉和EMS工作液按1∶10（V/V）混合，在28 ℃搖床上搖5 min，間隔5 min，如此重復，持續(xù)45 min；然后用毛筆將石蠟油和花粉的混合液均勻地刷在玉米花絲上，將雌穗套袋并做好標記。B73、鄭58各自誘變200株。
1.2.2 EMS突變體庫繁育及突變體篩選。EMS突變體庫繁育小區(qū)行長5 m，行距60 cm，株距25 cm。EMS誘變果穗成熟后得到M1種子，M1種子全部單粒播種。從M1自交所得的每個M2果穗上隨機選取20粒種子，單粒播種成1行，即穗行種植，每行為一個M2家系，每15行突變體設有1行野生型對照。在每一個M2家系中，篩選突變體并做表型記錄，突變體全部自交（不育的例外），無明顯突變表型的自交5株，每個M2家系及突變體都掛牌標記。
1.2.3 密植試驗設計。采用裂區(qū)試驗設計，3種種植密度為主處理，rla1的M4代、rla2的M4代、野生型B73為副處理，重復3次，小區(qū)面積為3 m×6 m，統(tǒng)計每個小區(qū)的產(chǎn)量，并換算成每公頃的產(chǎn)量。
1.2.4 遺傳學分析。rla1、rla2分別與B73野生型回交，觀察F1表型，統(tǒng)計F2群體中的野生表型和突變表型的數(shù)量。rla1和rla2雜交，觀察F1后代表型。
2 結果與分析
2.1 突變體庫建立 EMS誘變分別得到B73、鄭58的M1種子9 736和9 258粒，全部單粒播種，出苗5 592和5 713株，出苗率分別為57.44%和61.71%。相同栽培條件下分別統(tǒng)計野生型B73、鄭58的出苗率分別為92.72%和94.08%。M1種子攜帶有大量的致死突變，包括無胚突變，印象種子萌發(fā)，因此M1種子出苗率大幅度下降[6]。B73、鄭58的M1植株自交分別獲得4 328和4 657個M2果穗，穗行播種成4 328和4 657行，單株分別有69 265和77 026株。
2.2 突變體表型統(tǒng)計 B73、鄭58突變體庫的M2代反應了豐富的遺傳變異，包括葉色、葉型、分蘗、表皮毛、抗性和株高等性狀（表2）。其中，矮化突變率最高，分別達到0.608%和0.458%，而鄭58的抗蟲和抗旱表型的突變頻率僅為0.003%。
2.2.1 葉色突變體。葉色突變體也稱為葉綠素突變體[7]，B73的M2代有93株白化苗（圖1A），142株黃化苗（圖1B），突變率分別為0.134%和0.205%；鄭58的M2代中有86株白化苗（圖1C）和93株黃化苗（圖1D），突變率分別為0.112%和0.121%。這類突變體直接或間接影響葉綠素的合成或降解，絕大部分隨著生長時間增長都枯萎死亡。但是某些淺綠色葉片突變體能夠正常生長發(fā)育（圖1E）。
2.2.2 棕色葉中脈突變體。玉米葉中脈一般是淺綠色的，鄭58的M2群體有9個的家系18株棕色葉中脈突變體（bm，Brown midrib）（圖1F、G），變率為0.023%。除了葉中脈，雄穗和莖稈也呈現(xiàn)棕色（圖1H、I）。bm的木質(zhì)素含量較低[8-9]，可提高青貯玉米的營養(yǎng)價值。 但在B73背景下，沒有得到bm的突變體。
2.2.3 葉型突變體。B73和鄭58的M2群體里都有葉型突變體，包括葉片變細、葉夾角變小突變類型。B73群體有9個家系13株細葉突變體（圖1J），鄭58群體有21個家系32株細葉突變體（圖1K），突變率分別為0.019%和0.042%。葉夾角突變體極少，B73群體僅有5個家系12株小葉夾角突變體（圖1L），鄭58群體有3個家系8株小葉夾角突變體（圖1M），突變率分別為0.017%和0.010%。
2.2.4 分蘗突變體。玉米的近緣種大芻草分蘗很多，玉米一般沒有分蘗，在B73的突變庫中發(fā)現(xiàn)了3個家系15株分蘗突變體（圖2A），突變頻率為0.022%。但在鄭58背景下沒有發(fā)現(xiàn)分蘗增加的突變體。
2.2.5 表皮毛增多突變體。表皮毛是植物組織表面一種毛狀結構附屬物，在B73的突變庫中共發(fā)現(xiàn)了7個家系23株葉鞘表皮毛增多突變體（圖2B），突變頻率為0.033%。
2.2.6 抗性突變體。從鄭58的M2群體中篩選到抗蟲和抗旱突變體各2株（圖2C～E），此種突變類型較為少見，突變率都為0.003%。
2.2.7 匍匐莖突變體。在鄭58突變?nèi)后w的13的家系里發(fā)現(xiàn)了72株匍匐莖突變體（圖2F），突變頻率為0.093%。此突變體莖稈匍匐在地，但可以正常開花結實。但在B73背景下沒有篩選到匍匐莖的突變體。
2.2.8 矮化突變體。B73和鄭58經(jīng)過EMS誘變后，株高受到很大影響，在突變體庫中發(fā)現(xiàn)了大量的矮化突變體，也是最多的一類突變體，B73突變?nèi)后w有285個家系421株矮化突變體（圖2G），鄭58突變?nèi)后w有198個家系353株矮化突變體（圖2H），突變率分別為0.608%、0.458%。
2.3 小葉夾角突變體表型鑒定及密植測產(chǎn) 小葉夾角是玉米優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，具有密植的潛力。從B73的12株小葉夾角突變體中選出2株（圖3A），這2株來自不同的M2家系，將其命名為rla1、rla2。這2個小葉夾角突變體表型相似，穗下葉夾角較開展，角度為15度，穗上葉片幾乎緊貼莖干生長，葉片開展角度為5°（圖3C），而野生型穗下葉片的開展角度為55°，穗上葉片開展角度為27°（圖3B）。進一步觀察發(fā)現(xiàn)rla1和rla2突變體無葉舌（圖3D）。
在每種種植密度下，隨機選取并統(tǒng)計B73 、rla1、rla2的果穗各15穗，結果顯示，在66 667株/hm2密度下，野生型和突變體果穗大小和重量相差不大（圖3E和表3），經(jīng)方差分析可知野生型和突變體單穗重差異不顯著（P>0.05）。隨著種植密度增加，野生型和2個突變體單穗重都下降，但是突
變體單穗重下降幅度相對較??；密度為83333株/hm2時，
注：A為B73白化苗；B為B73黃化苗；C為鄭58白化苗；D為鄭58黃化苗；E為B73淺綠色葉片突變體；F和G為鄭58野生型和bm突變體的葉中脈；H為鄭58野生型和bm的雄穗；I為鄭58野生型和bm的莖稈；J為B73野生型和細葉突變體的葉片；K為鄭58野生型和細葉突變體的葉片；L為B73野生型和小葉夾角突變體；M為鄭58野生型和小葉夾角突變體。
進一步研究其秸稈中木質(zhì)素的結構和含量，有望為生物乙醇生產(chǎn)提供優(yōu)良資源，提高乙醇生產(chǎn)率。鄭58的抗蟲和抗旱突變體無其他不良性狀，不用經(jīng)過轉(zhuǎn)基因?qū)徟?，可直接用于抗蟲和抗旱玉米育種。矮化玉米抗倒伏，耐密植，群體光能利用效率高，鄭58、B73突變體庫中矮化突變體最多，可用于矮化育種，培育耐密植型矮化玉米新品種。葉夾角是玉米株型的重要方面，小葉夾角可明顯提高玉米的種植密度和群體光合效率，進而增加產(chǎn)量。小葉夾角變突變體rla1、rla2株型緊湊，耐密植，而且密植潛力大于100 000株/hm2，為密植型玉米新品種的培育提供了寶貴的種質(zhì)資源。
參考文獻
[1] 祝麗英，池書敏，劉志增，等.甲基磺酸乙酯（EMS）在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應用[J].玉米科學，2001，9（3）：14-17.
[2] 趙永亮，宋同明.玉米化學誘變研究進展[J].華北農(nóng)學報，1996，11（4）：24-28.
[3] 薛守旺，周洪生，鄧迎海，等.化學誘變及其在玉米育種上的應用[J].玉米科學，1998，6（2）： 10-17.
[4] 劉治先.玉米育種新技術[J].玉米科學，1995，3（4）：12-15.
[5] NEUFFER M G.Paraffin oil technique for treating mature corn pollen with mutagens[J].Maydic，1978，23（1）：21-28.
[6] BENNETZEN J L，HAKE S.Handbook of maize：Genetics and Genomics [M].New York： Springer，2009： 67-67.
[7] 呂典華，宗學鳳，王三根，等.兩個水稻葉色突變體的光合特性研究[J].作物學報，2009，35（12）： 2304-2308.
[8] VIGNOLS F，RLGAU J，TORRES M A，et al.The brown midrib3（bm3）Mutation in Maize occurs in the Gene Encoding Caffeic Acid OMethyltransferase [J].Plant Cell，1995，7（4）： 407-416.
[9] 劉豪，許慶方.褐色葉中脈突變體的研究進展[J].畜牧與飼料科學，2009，30（9）：75-76.
[10] BUCKLER E S，GAUT B S，MCMULLEN M D.Molecular and functional diversity of maize[J].Curr Opin Plant Biol，2006，9（2）：172-176.
[11] MARITA J，VERMERRIS W，RALPH J，et al.Variations in the cell wall composition of maize brown midrib mutants[J].J Agric Food Chem，2003，51（5）：1313-1321.
[12] BARRIRE Y，RALPH J，MCHIN V，et al.Genetic and molecular baisis of grass cell wall biosynthesis and degradability.II.Lessons from brown midrib mutants [J].C R Biologies，2004，327（9/10）： 847-860.
當前位置:
玉米EMS突變體庫構建及突變體初步鑒定
來源：環(huán)球糧機網(wǎng)發(fā)布時間：2015-06-15 13:12:47
