目前，通常采用溫浸、超聲輔助等方法提取油菜籽中的原花青素，但其操作步驟較為復(fù)雜，且耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)所需溶劑量相對(duì)較大。加速溶劑萃取(Acceleratedsolventextraction，ASE)是在較高溫度和壓力條件下，采用有機(jī)溶劑從固體或半固體基質(zhì)中提取分析物的一種全新樣品前處理技術(shù)，具有萃取時(shí)間短、溶劑用量少、提取率高、操作模式簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度較高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。在食品、農(nóng)藥殘留等方面得到廣大應(yīng)用，該技術(shù)已經(jīng)被美國(guó)環(huán)保局批準(zhǔn)為EPA3545號(hào)標(biāo)準(zhǔn)方法。
　　
　　響應(yīng)面最早是由數(shù)學(xué)家Box和Wilson于1951年提出來(lái)，常用的正交試驗(yàn)法只能得出最佳實(shí)驗(yàn)組合，不能充分的反映因素間對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相互影響，而響應(yīng)面法是統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合的一種軟件，其應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，但現(xiàn)階段在天然產(chǎn)物分析中應(yīng)用較少。
　　
　　本實(shí)驗(yàn)以油菜籽餅粕為原料，采用加速溶劑萃取法提取原花青素，響應(yīng)面分析法優(yōu)化最佳提取條件，并與超聲提取法進(jìn)行了對(duì)比。
　　
　　1材料與儀器
　　
　　1．1材料油菜籽購(gòu)于平安種業(yè)公司；Folin—Ciocaheu試劑、沒(méi)食子酸、2，2一diphenyl一1一picrylhydrazyl[DPPH·]購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(S．tLouis，Mo)；無(wú)水乙醇為分析純?cè)噭?購(gòu)于北京精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司)；水為超純水18．21~Pa。
　　
　　1．2儀器
　　
　　ASE一150加速溶劑萃取儀(美國(guó)Dionex公司)；Beckman—DU800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司)；N一1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)郎儀器有限公司)；BS一124S電子天平(德國(guó))；Elma—S180H超聲清洗器(德國(guó))；加樣槍(德國(guó))。
　　
　　2方法
　　
　　2．1ASE提取精密稱取20目油菜籽餅粕2．0064g置小燒杯中，然后與6．0012g硅藻土進(jìn)行完全混合，按照加速溶劑萃取儀樣品制備程序，以乙醇為溶劑，按響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表1選擇因素和水平進(jìn)行提取，萃取后的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干(<50oC)，用60％的乙醇4ml溶解，過(guò)0．45m的微孔濾膜，得樣品溶液，在一4℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存。
　　
　　2．2傳統(tǒng)超聲提取稱取20目油菜籽餅粕2．0064g，置于錐形瓶中，按料液比1：20(g／m1)加入60％的乙醇溶液，在60℃下超聲20min，超聲3次。過(guò)濾后的溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至于(<50℃)，用60％的乙醇4ml溶解，過(guò)0．45m的微孔濾膜，得樣品。參照“2．3．2”項(xiàng)下測(cè)定其含量。
　　
　　2．3油菜籽原花青素含量的測(cè)定
　　
　　2．3．1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)濃度100ml的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取0，0．05，0．10，0．20，0．30ml于10ml容量瓶中，再分別加入0．5mlFolin—Ciocalteau試劑(2mol／L)。搖勻后加人3ml10％NaCO溶液，再用蒸餾水定容，于75℃水浴中反應(yīng)10min，測(cè)定波長(zhǎng)為765nm的吸光度值。以吸光度(A)對(duì)沒(méi)食子酸濃度(C)進(jìn)行線性回歸分析，考察其在0，5～3．5ml范圍內(nèi)的線性關(guān)系。見(jiàn)圖1。
　　
　　2．3．2含量的測(cè)定按響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案，參照“2．1”項(xiàng)，制備17份樣品。準(zhǔn)確移取樣品溶液10l，用60％乙醇稀釋10倍后取501，按“2．3．1”項(xiàng)方法處理樣品溶液，同樣測(cè)定波長(zhǎng)為765nm的吸光度值，代入回歸方程計(jì)算得到原花青素含量。
　　
　　2．4實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選擇乙醇濃度、萃取溫度和循環(huán)次數(shù)三個(gè)因素為自變量，以原花青素含量為晌應(yīng)值(Y)，根據(jù)Box—Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合張小軍、吳娟提取原花青素的最佳條件的基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。
　　
　　3結(jié)果與討論
　　
　　3．1響應(yīng)面分析采用Box—Behnken按表1響應(yīng)面分析因素及水平表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，共17組。每個(gè)自變量的低中高水平分別以一1、0、1進(jìn)行編碼，以原花青素的提取量為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，參照“2．1”項(xiàng)進(jìn)行提取
 

　　3．2多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析采用Design—Ex—pert軟件對(duì)表2的提取量和影響因素進(jìn)行多元回歸分析和最小二乘法擬合，得提取量對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸模擬方程為Y=5．16—0．40Xl+0．038+0．92X3+0．45X1一0．67X1+0．21X一0．63X】一0．49+0．51X3。該方程表達(dá)了油菜籽餅粕中原花青素的提取量與加速溶劑萃取各提取因素之間的變化規(guī)律。
　　
　　其中，是效應(yīng)值，即原花青素的提取量X₁、X₂、X₃是自變量，即乙醇濃度、萃取溫度和循環(huán)次數(shù)3個(gè)考察因素。。
　
　　結(jié)果表明，該模型的F值為4．46，概率P=0．0308<0．05，表明模型顯著。同時(shí)，方程的失擬項(xiàng)F值為3．78，概率P>0．05，失擬項(xiàng)不顯著。模型的值為0．8514，說(shuō)明方程的因變量與全體自變量間線性關(guān)系較顯著，響應(yīng)值的變化有85．14％來(lái)源于所選自變量，即乙醇濃度、萃取溫度、循環(huán)次數(shù)，說(shuō)明回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　
　　原花青素提取量對(duì)乙醇濃度、萃取溫度、和循環(huán)次數(shù)的響應(yīng)面圖(見(jiàn)圖2～4)。圖2～4反映的是一個(gè)因素不變的前提下(取值都為0．000)，另外兩個(gè)因素對(duì)于原花青素提取量的相互情況。
　　由圖2可知，原花青素提取量隨著溫度的升高而增加，但增加到一定溫度時(shí)，繼續(xù)升高溫度提取率有所下降，見(jiàn)圖2b，溫度為5O℃時(shí)，提取量約為4．000mg／g，60℃時(shí)，提取量最高，約為5．000mg／g，繼續(xù)升高溫度，提取量明顯下降。說(shuō)明在一定范圍內(nèi)溫度的升高有利于原花青素的提取，可當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，原花青素的結(jié)構(gòu)可能由于遭到破壞，導(dǎo)致提取量降低。從圖2中分析得到，乙醇在較低的濃度下提取效果較好，說(shuō)明原花青素易溶于極性較大的溶劑中，但如果乙醇濃度過(guò)低，所提取的水溶性雜質(zhì)增多。
　　
　　由圖3可知，循環(huán)次數(shù)對(duì)提取量的影響較為顯著，循環(huán)次數(shù)增大時(shí)，原花青素的提取量升高顯著。說(shuō)明隨著次數(shù)的不斷增加，油菜籽餅粕中原花青素提取的越完全。循環(huán)一次原花青素的提取量為4．434mg／g，循環(huán)兩次原花青素的提取量不到5．000m#g，循環(huán)3次之后，提取量達(dá)到了7．000mg／g左右。循環(huán)次數(shù)越多，所用的溶劑量就越大，考慮到溶劑的用量，選取循環(huán)3次。
　　
　　由圖2—4和表3可知，循環(huán)次數(shù)是影響油菜籽餅粕中原花青素提取量的顯著因素。并且由圖4可知，循環(huán)次數(shù)為3次，萃取溫度為60℃時(shí)，原花青素的提取量最多，達(dá)到6．700mg／g左右。

　　通過(guò)Design—Expert進(jìn)行最佳提取條件分析，以原花青素的提取量為考察指標(biāo)，確定了ASE的最佳提取條件是：X₁=60.83%，X₂=58.32℃，X₃=3，在此條件下，原花青素提取量的理論值為7.060mg/g。考慮到實(shí)際操作，確定最佳提取條件為：乙醇濃度60%，萃取溫度60%，循環(huán)次數(shù)3次。同時(shí)，在此條件下，進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，原花青素的平均提取量為7．217mg／g，油菜籽中原花青素的提取量比張小軍的超聲法較低，可能由于原料產(chǎn)地、收獲季節(jié)等有關(guān)。
　　
　　3．3與超聲提取法的比較ASE與超聲提取法主要從溶劑用量、時(shí)間、原花青素的提取量3個(gè)方面進(jìn)行了比較。結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，采用ASE提取方法，原花青素的提取量為7．217mg／g，溶劑用量為65ml，時(shí)間為40min，無(wú)論從溶劑用量、提取時(shí)間還是原花青素的提取量來(lái)說(shuō)，都優(yōu)于超聲提取法，并且操作自動(dòng)化。由此可見(jiàn)，ASE提取方法是一種提取原花青素的新方法。
　　
　　4結(jié)論
　　
　　本文采用加速溶劑萃取方法對(duì)油菜籽餅粕中原花青素進(jìn)行提取，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化了最佳提取條件：乙醇濃度6o％，萃取溫度60℃，循環(huán)次數(shù)為3次，提取量最高可達(dá)7．370mg／g，而采用超聲法原花青素的提取量不到7．000m#g。響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝克服了正交法不能研究因子與響應(yīng)值之間、因子與因子之間相互關(guān)系缺陷。加速溶劑萃取法相比超聲提取法具有萃取時(shí)間短、溶劑用量少、提取效率高等優(yōu)勢(shì)，因此，加速溶劑萃取方法為提取、研究油菜籽餅粕中的原花青素提供了一種簡(jiǎn)單、快速的分析方法。
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