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大量研究表明，茶皂苷具有良好的乳化、分散、潤(rùn)濕、發(fā)泡以及去污等表面活性，同時(shí)還具有抗?jié)B、消炎、抗氧化、殺菌、抗高血壓、抑制酒精吸收等生物活性。中藥材的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，而植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素，利用纖維素酶酶解可以破壞纖維素上的一D一葡萄糖苷鍵，使細(xì)胞壁遭到破壞，有利于有效成分的溶出J。目前，纖維素酶應(yīng)用在茶皂苷提取中的研究所見(jiàn)不多。鑒于此，本文利用纖維素酶輔助提取茶籽粕中茶皂苷，以茶皂苷得率為指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件。
1材料與方法
1．1試驗(yàn)材料
1．1．1原料、試劑
茶籽粕，由玉溪師范學(xué)院提供；茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于西安依科生物技術(shù)有限公司；纖維素酶(酶活10000U／g)，購(gòu)于諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司。石油醚、冰乙酸、乙酸鈉、無(wú)水乙醇、香草醛、濃硫酸等，均為分析純。
1．1．2儀器、設(shè)備
PB一10標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)，7230G型可見(jiàn)分光光度計(jì)，HH一2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，DZF一6050型真空干燥箱，SNE一3000M型移動(dòng)式形貌分析系統(tǒng)(韓國(guó)賽可有限公司)。
1．2試驗(yàn)方法
1．2．1茶皂苷的提取
準(zhǔn)確稱取5g經(jīng)石油醚脫脂的茶籽粕，加入40mL調(diào)好pH的乙酸一乙酸鈉緩沖溶液，加人一定量的纖維素酶，充分?jǐn)嚢韬笾糜诤銣厮∶附庖欢螘r(shí)間。酶解結(jié)束后，升溫至85℃滅酶5min。離心，取上層提取液測(cè)定茶皂苷含量。
1．2．2茶皂苷的含量測(cè)定
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制_5]：精密稱取干燥至恒重的茶皂苷標(biāo)準(zhǔn)品30．1mg，用80％乙醇定容至50mL。從中精密吸取0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL樣品溶液置于5支試管中，分別用80％乙醇補(bǔ)至0．5mL。各加入8％香草醛的乙醇溶液0．5mL、77％硫酸5mL，于60oI=水浴加熱20min，立即置于冰水浴中冷卻10min，取出。待溫度降至室溫，以試劑空白為參比，于545nm處測(cè)定吸光度。以吸光度A為縱坐標(biāo)，茶皂苷質(zhì)量濃度C(mg／mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：A=9．5585C+0．0019(R=0．9998)。
提取液中茶皂苷的測(cè)定及得率計(jì)算：取1mL提取液置于10mL具塞試管中，用80％乙醇定容，搖勻。從中移取0．1mL樣品溶液并用80％乙醇補(bǔ)至0．5mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法加人顯色劑進(jìn)行顯色，測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算可得到茶皂苷的質(zhì)量(mg)，再以其計(jì)算得率。
茶皂苷的質(zhì)量=600(A一0．0019)V／9．5585式中：600為稀釋倍數(shù)；A為溶液的吸光度；V為茶皂苷提取液體積，mL。得率=提取所得茶皂苷的質(zhì)量／脫脂茶籽粕的質(zhì)量×100％
2結(jié)果與討論
2．1酶解條件的單因素試驗(yàn)
2．1．1pH對(duì)茶皂苷得率的影響在酶解溫度5O℃、酶解時(shí)間120min、纖維素酶加入量1．25mg／mL(纖維素酶加入量均以40mL提取液計(jì)，下同)的條件下提取茶皂苷，不同pH對(duì)茶皂苷得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。
由圖1可知，當(dāng)乙酸一乙酸鈉緩沖溶液pH為5．0時(shí)茶皂苷得率達(dá)到最大值，pH偏大或偏小都會(huì)破壞纖維素酶的空間構(gòu)象，降低酶的活性。因此，pH取5．0較為適宜。
2．1．2酶解溫度對(duì)茶皂苷得率的影響在pH5．0、酶解時(shí)間120min、纖維素酶加入量1．25mg／mL的條件下提取茶皂苷，不同酶解溫度對(duì)茶皂苷得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。
由圖2可知，茶皂苷得率隨酶解溫度先增大后減小，且在45℃時(shí)茶皂苷得率達(dá)到最大值。故酶解溫度選擇45℃。
2．1．3酶解時(shí)間對(duì)茶皂苷得率的影響在pH5．0、酶解溫度45℃、纖維素酶加入量1．25mg／mL的條件下提取茶皂苷，不同酶解時(shí)間對(duì)茶皂苷得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可知，茶皂苷得率在酶解時(shí)間為120min時(shí)達(dá)到最大值，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，茶皂苷得率變化幅度不大，且存在逐漸降低的趨勢(shì)?？赡苁怯捎诿附鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，纖維素酶破壞了部分茶皂苷的結(jié)構(gòu)。因此，酶解時(shí)間選擇120min。
2．1．4纖維素酶加入量對(duì)茶皂苷得率的影響在pH5．0、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間120min的條件下提取茶皂苷，不同纖維素酶加入量對(duì)茶皂苷得率的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。
由圖4可知，纖維素酶加入量從0．375～1．125me／mL時(shí)，茶皂苷得率顯著升高，當(dāng)纖維素酶加入量超過(guò)1．125me／mL時(shí)，茶皂苷得率反而呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)，可能是纖維素酶加入量過(guò)高造成部分茶皂苷的分解。因此，纖維素酶加入量選擇1．125me／mL。
2．2酶解條件的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化
2．2．1正交試驗(yàn)
根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選擇pH、酶解溫度、酶解時(shí)間、纖維素酶加入量4個(gè)因素，設(shè)計(jì)L。正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)的因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
由表2極差分析的結(jié)果可知，各因素對(duì)茶皂苷得率的影響程度為：A>D>C>B，即pH對(duì)茶皂苷得率的影響最大，其次是纖維素酶加入量、酶解時(shí)間、酶解溫度。酶法輔助提取茶皂苷的最佳工藝為A3B3C，D，即pH5．1、酶解溫度47℃、酶解時(shí)間130rain、纖維素酶加入量1．125me／mL。
2．2．2驗(yàn)證試驗(yàn)
在最佳酶法提取工藝條件下，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)。經(jīng)茶皂苷含量檢測(cè)，其平均得率為20．23％，優(yōu)于各組正交試驗(yàn)。
2．3酶解前后茶籽粕的掃描電鏡分析
對(duì)纖維素酶酶解前后的脫脂茶籽粕進(jìn)行了掃描電鏡分析，結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6。
從圖5、圖6可以看出，酶解前的脫脂茶籽粕表面較為平整光滑、茶籽粕顆粒之間無(wú)明顯粘連現(xiàn)象；而酶解1h后的脫脂茶籽粕表面粗糙、茶籽粕顆粒之問(wèn)互相粘連、茶籽粕顆粒的結(jié)構(gòu)遭到破壞。這從另一方面驗(yàn)證了纖維素酶對(duì)茶籽細(xì)胞壁的破壞作用。
3結(jié)論
以茶籽粕為原料，將纖維素酶解輔助提取技術(shù)運(yùn)用到茶皂苷的提取中。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝為：pH5．1，酶解溫度47℃，酶解時(shí)問(wèn)130min，纖維素酶加入量1．125me／mL。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，茶皂苷得率為20．23％。對(duì)酶解前后的脫脂茶籽粕進(jìn)行的掃描電鏡分析表明：酶解后茶籽粕顆粒表面變得粗糙、顆粒之間相互粘連，說(shuō)明纖維素酶破壞了茶籽細(xì)胞壁，從而促進(jìn)茶皂苷的溶出。
