公告信息：
在生物體內(nèi)，生物大分子的氧化是一個(gè)由自由基介導(dǎo)的必要的生理過程。但是過量的自由基則會(huì)給細(xì)胞帶來傷害甚至死亡，導(dǎo)致癌癥、中風(fēng)、糖尿病及心肌梗塞等疾病的發(fā)生。已有研究表明，食物來源的生物活性肽具有在體內(nèi)清除自由基的能力，并且比合成的抗氧化劑更安全．目前，對食物蛋白質(zhì)來源的酶水解物的抗氧化性研究主要集中在大豆蛋白、小麥蛋白、鹿茸和魚等，而對核桃蛋白水解物抗氧化性的研究報(bào)道則較少．本文以堿性蛋白酶(Alcalase2．4L)水解核桃蛋白，對獲得的水解產(chǎn)物進(jìn)行了葡聚糖凝膠柱和反相層析分離純化，測定了水解物對DPPH和羥自由基的清除能力，探討了核桃蛋白水解物的抗氧化活性；對抗氧化能力強(qiáng)的多肽采用LC．ESI—Q—TOF鑒定了其一級(jí)序列。
1實(shí)驗(yàn)部分
1．1材料、試劑與儀器
核桃購自長春沃爾瑪超市；堿性蛋白酶Alcalase2．4L購自丹麥Novozymes公司；HPLC級(jí)乙腈購自美國Fisher公司；1，1-diphenyl-2一picrylhydrazyl(DPPH)，L-glutathionereduced(GSH)購自Sigma公司。
WatersAlliance2695高效液相色譜系統(tǒng)；Waters2996二極管陣列檢測器；RRLC—Q—TOF6520質(zhì)譜儀(Agilent公司)；ZORBAXExtend—C18色譜柱(1．8um，2．1mmxl50mm，Agilent公司)；多功能酶標(biāo)儀(Tecan公司)。
1．2核桃蛋白酶解物的制備與分離純化
1．2．1核桃蛋白的制備將核桃去皮粉碎過40目篩，用石油醚脫脂2次(料液體積比1：10)；用NaOH調(diào)節(jié)pH=9．0，于45℃孵育lh，以3500r／min轉(zhuǎn)速離心30min，取上清液調(diào)節(jié)pH=4．5后靜置，以3500rmin轉(zhuǎn)速離心30min，將沉淀用水洗至中性，凍干即得核桃蛋白。
1．2．2核桃蛋白酶解物的制備取一定量的核桃蛋白用水溶解(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％)，用0．5mol／LNaOH調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH=8．0，于50℃恒溫振蕩反應(yīng)。將50℃預(yù)熱的堿性蛋白酶(Alcalase2．4L)加人到反應(yīng)體系中，啟動(dòng)酶解反應(yīng)；反應(yīng)過程中加入NaOH以維持反應(yīng)體系的pH值。反應(yīng)3h后，于90℃水浴保持10rain，使酶失活；以3500r／min轉(zhuǎn)速離心30rain，上清液即為核桃蛋白酶解物。
1．2．3核桃蛋白酶解物的分離純化將核桃蛋白酶解物用截留分子量(MWCO)為3000的超濾管進(jìn)行超濾，超濾組分進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)．對核桃蛋白酶解物超濾后抗氧化強(qiáng)的組分進(jìn)一步用SephadexG-25凝膠層析柱分離純化，收集各組分、凍干，進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)篩選．取SephadexG-25純化后抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)一步用HPLC純化，收集各組分、凍干，進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)篩選．
1．3核桃蛋白酶解物的抗氧化活性研究
1．3．1DPPH清除能力(DRSA)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法測定酶解物的DPPH清除能力，DPPH清除能力按下式計(jì)算：
式中，As為蛋白酶解物的吸光度；Ab為樣品背景的吸光度(不加DPPH)；Ac為對照管的吸光度(水代替樣品)．
1．3．2羥基自由基(·OH)清除能力(HRSA)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法測定酶解物的羥基自由基清除能力，羥自由基清除能力按下式計(jì)算：
式中，A8為蛋白酶解物的吸光度；A1為損傷管的吸光度(水代替樣品)；A0為未損傷管的吸光度(水代替雙氧水)．
1．3．3還原力的測定參照文獻(xiàn)方法，以酶解物還原三價(jià)鐵為二價(jià)鐵，用鐵氰化鉀檢測二價(jià)鐵，溶液在500nin處有吸收，吸光度值與還原力成正比．
1．4核桃蛋白酶解多肽的序列鑒定
將HPLC純化后抗氧化活性最強(qiáng)的組分先用UPLC測定其純度，再用LC．ESI-Q．TOF手段鑒定肽段的一級(jí)序列．
UPLC條件：流動(dòng)相A為超純水[含0．1％甲酸(體積分?jǐn)?shù))]，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫：5％-50％B(0～14min)；柱溫30oC；流速0．3mL／min；進(jìn)樣量10ul測序色譜條件：流動(dòng)相A為超純水[含0．1％甲酸(體積分?jǐn)?shù))]，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫：5％～70％B(O一20min)，70％B(20—25rain)；柱溫30℃；流速0．3mL／min；進(jìn)樣量10斗ul。
測序質(zhì)譜條件：電噴霧正離子電離模式，質(zhì)量掃描范圍m／z50～2000，氣體溫度350oC，干燥氣流速9L／min，噴霧氣壓0．28MPa，毛細(xì)管電壓3．5kV，裂解電壓150V，錐孔電壓65V．利用PeaksViewer4．5軟件(BioinformaticsSolutionsInc．)和手動(dòng)計(jì)算相結(jié)合的方式鑒定多肽序列．
2結(jié)果與討論
2．1核桃蛋白酶解物的分離與純化
利用超濾管超濾核桃蛋白酶解物后，用DPPH清除實(shí)驗(yàn)及羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)來檢測酶解物分子量分別大于和小于3000的組分的抗氧化活性．結(jié)果表明，酶解物分子量小于3000的組分具有更強(qiáng)的抗氧化能力，故取此組分進(jìn)行下一步分離純化．經(jīng)SephadexG-25分離純化共獲得4個(gè)主要洗脫峰F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3和F4[圖1(A)]；經(jīng)抗氧化實(shí)驗(yàn)[圖1(B)]發(fā)現(xiàn)F2具有更強(qiáng)的抗氧化活性．收集砣組分，凍干后進(jìn)一步利用HPL純化[圖2(A)]，發(fā)現(xiàn)F2-5抗氧化活性最強(qiáng)，多次收集，凍干2．2核桃蛋白酶解物的抗氧化活性DPPH自由基清除能力測定是一種常見的篩選和評(píng)價(jià)抗氧化劑活性的有效方法．DPPH是一種較為穩(wěn)定的自由基，分子結(jié)構(gòu)中有未成對電子，其乙醇溶液呈藍(lán)紫色，在517nm處有最大吸收值．當(dāng)未成對電子被其它自由基電子配對后，吸收值降低，其褪色程度與所接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系．當(dāng)與抗自由基活性物質(zhì)反應(yīng)時(shí)，溶液顏色變淺，吸收值降低．吸收值越低表明該物質(zhì)的抗自由基活性越強(qiáng)．羥基自由基清除力的測定選用鄰二氮菲法，以H：0：／Fe2+體系通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，總反應(yīng)可表示如下：
Fe2++H202—_Fe3++OH一+·OH鄰二氮菲一Fe2+水溶液被羥自由基氧化為鄰二氮菲一Fe3+后，其515nm吸收峰明顯降低，根據(jù)以上原理，變化反映羥自由基的氧化作用．
圖1(B)和圖2(B)分別為核桃蛋白酶解物經(jīng)過SephadexG-25純化后的4個(gè)組分(F1，砣，F(xiàn)3和F4)和組分F2經(jīng)過HPLC分離純化后各組分的DP—PH和羥基自由基清除力測定結(jié)果．圖1(‘B)顯示，4個(gè)組分均具較好的DPPH和羥基自由基清除力，其中F2的抗氧化能力最強(qiáng)．圖2(B)顯示，F(xiàn)2-5的DPPH和羥基自由基清除力最強(qiáng)，收集多次凍干，分別用于測定還原力實(shí)驗(yàn)和多肽序列．
圖3為組分F2-5．、陽性對照還原型谷胱甘肽(GSH)及二丁基羥基甲苯(BHT)的還原力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣品的抗氧化能力與還原力密切相關(guān)，19J還原力越強(qiáng)則吸光度值越大。隨著F2-5、谷胱甘肽和二丁羥基甲苯濃度的增大，還原力逐漸增強(qiáng)；當(dāng)F2-5濃度為1mg／mL時(shí)還原力達(dá)到1．5，與谷胱甘肽相當(dāng)，說明F2—5具有較好的還原力．
2．3核桃蛋白酶解多肽的序列鑒定
將F2-5凍干樣品用水溶解，先用液相色譜測定其純度，結(jié)果顯示譜圖中(圖4)只有1個(gè)峰，可見其為純品；再利用液相色譜一質(zhì)譜進(jìn)行序列鑒定．MS／MS圖譜利用專業(yè)軟件Peaks的denovo功能進(jìn)行分析，所得結(jié)果再手動(dòng)計(jì)算確認(rèn)，結(jié)果如圖5所示．F2-5的氨基酸序列為A1a-Gly—Gly—A1a．Chen等M’2叫和Sampath等指出，活性肽中疏水性氨基酸有利于增加脂溶性，抑制油脂的氧化；甘氨酸的側(cè)鏈只有1個(gè)氫原子，多肽骨架具有較高的靈活度，有利于增加多肽的抗氧化能力舊，故本文中的活性肽也具有一定的抗氧化活性．
3結(jié)論
核桃蛋白質(zhì)通過堿性蛋白酶水解后得到的酶解物具有較強(qiáng)的抗氧化活性；經(jīng)過多步分離純化后得到多肽Ala—Gly—Gly—Ala，其還原力和谷胱甘肽相當(dāng)．本文為進(jìn)一步研究核桃多肽的抗氧化機(jī)理及核桃的深加工提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為核桃作為抗氧化的保健品及藥品食品添加劑的開發(fā)提供了思路。
