生物柴油是利用動(dòng)植物油脂的低碳醇在催化劑的作用下經(jīng)酯交換反應(yīng)生成的脂肪酸酯。作為一種新型環(huán)保的可再生替代燃油燃料，生物柴油在近幾十年來(lái)已成為學(xué)者們熱衷的研究對(duì)象。生物柴油與化石燃料相比，具有低閃點(diǎn)、低含硫量、溫室氣體凈排放量為零等優(yōu)勢(shì)，可以替代普通柴油更為清潔、安全地使用，極具發(fā)展前景。

 

 

 

 

生物柴油的合成需要催化劑的參與，催化劑可以為酸、堿或酶。酸催化法對(duì)原料油脂要求較高，會(huì)產(chǎn)生大量廢酸，且催化劑難以回收利用；堿催化法要求原料酸價(jià)小于1，含水量小于0.5%，生產(chǎn)工藝復(fù)雜，易皂化；相比之下，酶催化反應(yīng)條件溫和，對(duì)原料油脂的品質(zhì)基本無(wú)要求，反應(yīng)產(chǎn)物易分離，應(yīng)用較為廣泛[2]。油脂與醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)通常使用的酶催化劑為脂肪酶。脂肪酶在自然界中來(lái)源豐富，現(xiàn)已能從60 多種微生物中獲取相應(yīng)脂肪酶。

 

 

目前商業(yè)化的脂肪酶種類繁多，主要包括Lipase A K, Lipase P S, LipozymeRM IM, Lipase PS-30, Novozym 435 等。脂肪酶的來(lái)源不同，反應(yīng)工藝往往不同。

 

 

1 酶法制備生物柴油的影響因素直接影響酶法制備生物柴油轉(zhuǎn)化速率的因素包括：油醇比、酶種類、酶用量、反應(yīng)溫度、水含量等。反應(yīng)時(shí)間不直接影響酶法制備生物柴油的轉(zhuǎn)化率，但直接影響反應(yīng)平衡程度和反應(yīng)產(chǎn)物飽和度等，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，生物柴油的轉(zhuǎn)化率最后趨于一定值[4]。

 

 

 

酶活性直接受反應(yīng)體系中甲醇含量的影響。當(dāng)?shù)孜餅榛旌衔飼r(shí)，反應(yīng)體系中甲醇的含量可適當(dāng)提高。為避免酶失活，可將甲醇分次加入。盛梅等[5]研究固定化酶催化菜籽油與甲醇合成生物柴油的反應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有機(jī)溶劑的使用可以明顯改善固定化脂肪酶的活性和穩(wěn)定性。同時(shí)，分批加入甲醇可以避免次性加入時(shí)過(guò)量甲醇對(duì)固定化脂肪酶活性的抑制作用。李俐林等[6]用叔丁醇作為反應(yīng)介質(zhì)，利用固定化脂肪酶催化優(yōu)質(zhì)原料甲醇醇解反應(yīng)制備生物柴油，消除了甲醇和甘油對(duì)酶的負(fù)面影響，酶的使用壽命顯著延長(zhǎng)。陳志鋒等[7]研究固定化脂肪酶Novozym 435 催化高酸廢油脂與乙酸甲酯酯交換制備生物柴油時(shí)發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致酶促交換反應(yīng)速率和甲酯產(chǎn)率顯著下降的主要原因是廢油脂中高含量的游離脂肪酸與乙酸甲酯反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物乙酸對(duì)酶有抑制作用。此外，實(shí)驗(yàn)證明在反應(yīng)體系中添加適量的有機(jī)堿不僅能大大提高酯交換反應(yīng)速率和甲酯產(chǎn)率，還能顯著提高固定化酶的操作穩(wěn)定性。

 

 

2 酶法制備生物柴油的方法與工藝

 

2.1 固定化脂肪酶法

 

 

脂肪酶固定化技術(shù)具有以下特點(diǎn)：酶活性、穩(wěn)定性高；易從產(chǎn)品中分離出，因此可重復(fù)使用。固定化脂肪酶一般以硅藻土為載體，通過(guò)吸附法制備。其中吸附法由于方法簡(jiǎn)單且成本較低，被認(rèn)為是大規(guī)模固定脂肪酶的最優(yōu)方法[8]。王鈺等[9]以地溝油為原料，固定化假絲酵母脂肪酶為催化劑催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油。對(duì)所制備生物柴油的組成及物理、化學(xué)性能的檢測(cè)結(jié)果體現(xiàn)出了生物柴油優(yōu)良的特性：合成的生物柴油純度達(dá)到了97.8%以上，精制后的產(chǎn)品閃點(diǎn)高于170 ℃，硫的質(zhì)量· 59 ·分?jǐn)?shù)低于0.0005 %，十六烷值高達(dá)73.6，在0# 柴油中添加了20%的生物柴油后，尾氣排放中CO 降低了28%，未燃燒的碳?xì)浠衔锝档土?6 %，NOx 降低了24 %，全負(fù)荷煙度下降幅度達(dá)到0.2～0.9 Rb。蔡志強(qiáng)等[10]探究了固定化脂肪酶分別催化酯化與醇解兩種方法合成生物柴油的最佳工藝條件。研究發(fā)現(xiàn)，酯化工藝的最佳工藝條件是：2%固定化脂肪酶，溫度為30 ℃，油酸∶甲醇=1∶1（摩爾比），分2 等摩爾流加甲醇，反應(yīng)時(shí)間24 h，或分3 次等摩爾流加甲醇，反應(yīng)時(shí)間36 h，酯化率都可以達(dá)到95%以上；醇解的最佳工藝條件是：4%固定化脂肪酶，溫度為30 ℃，菜籽油∶甲醇=1∶3（摩爾比），分3 次等摩爾流加甲醇，反應(yīng)時(shí)間為48 h，酯化率可以達(dá)到95%以上，去除下層甘油后，菜籽油甲酯純度可達(dá)98%。安永磊等[11]利用固定化脂肪酶催化餐飲廢油與乙醇反應(yīng)制備生物柴油。通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了酯化反應(yīng)的最佳條件：反應(yīng)溫度47 ℃，有機(jī)溶劑為正己烷，醇油比3∶1，5 次投加乙醇，酶用量為0.3 g，反應(yīng)時(shí)間32 h 時(shí)，生物柴油產(chǎn)率可達(dá)81%。徐桂轉(zhuǎn)等[12]利用固定化脂肪酶Novozym 435，在無(wú)有機(jī)溶劑存在的情況下，催化菜籽油與甲醇酯交換反應(yīng)制取生物柴油。研究得到了菜籽油間歇酯交換反應(yīng)的適宜工藝條件：轉(zhuǎn)速200 r/min ，反應(yīng)溫度：50 ℃，甲醇∶菜籽油=1∶5（摩爾比），酶用量10%（與菜籽油的質(zhì)量比）。反應(yīng)分兩次加入等量甲醇，即先加入總量一半的甲醇，反應(yīng)10 h（菜籽油的酯交換率達(dá)到47%）；再加入剩下全部甲醇，反應(yīng)26 h（酯交換率達(dá)到80%）。唐鳳仙等[13]以戊二醛交聯(lián)殼聚糖固定的A.niger Li-38 脂肪酶催化棉籽毛油合成生物柴油取得了不錯(cuò)的效果。研究發(fā)現(xiàn)該固定化酶的貯藏穩(wěn)定性較好，室溫放置12 d, 酶活性仍能保持80%以上。固定化酶在30~70 ℃，pH=5.5~6.5 之間較穩(wěn)定，其熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性較游離酶有所提高。固定化酶可重復(fù)使用7 次，轉(zhuǎn)化率保持在80%以上。洪鯤等[14]研究了兩種脂酶順序催化制備生物柴油的生產(chǎn)工藝。結(jié)果表明：固相化細(xì)菌A007 脂酶催化甘油三酯（TAG）水解的最適條件為：含水量40%、脂酶用量100 U/g、反應(yīng)溫度30 ℃、反應(yīng)時(shí)間12 h，此時(shí)TAG水解率和游離脂肪酸（FFA） 含量分別為93.3%和90.1%；在催化FFA 甲酯化過(guò)程中，固相化Candidaantarctica 脂酶在FFA∶甲醇=1∶5 時(shí)可達(dá)到最佳效果；在第二次甲酯化時(shí)，加入甘油有利于提高FFA 酯化率，經(jīng)過(guò)24 h 反應(yīng)，可將總酯化率從無(wú)甘油時(shí)的96.9%提高到98.6%。

 

 

 

 

2.2 液體脂肪酶法

 

 

 

 

 

早在1970 年代許多學(xué)者就發(fā)現(xiàn)脂肪酶在油水界面上催化反應(yīng)速率較快，A. M. Brzozowski 等[15]將此現(xiàn)象解釋為“界面活化效應(yīng)”。一般而言，脂肪酶活性位點(diǎn)為一個(gè)蓋子所罩住，界面活化效應(yīng)是指將此蓋子打開(kāi)使催化活性位點(diǎn)暴露出來(lái)。液體脂肪酶通過(guò)催化兩相（油相/水相）體系界面的轉(zhuǎn)酯/酯化反應(yīng)制備生物柴油?；陔p相體系、油水界面活性效應(yīng)的特點(diǎn)，液體酶法催化制備生物柴油的反應(yīng)速率較快，不受底物、產(chǎn)物的擴(kuò)散限制，產(chǎn)物、副產(chǎn)物易分離。此外，液體脂肪酶生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，成本低廉[16]。許多學(xué)者對(duì)脂肪酶的蓋式結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探究。薛龍吟等[17]比較了黑曲霉脂肪酶與黑曲霉酯酶的3-D 結(jié)構(gòu)后發(fā)現(xiàn)兩者在蓋子結(jié)構(gòu)域存在顯著差異。他們利用PCR 技術(shù)對(duì)黑曲霉脂肪酶的4 個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行誘變，以期獲得開(kāi)蓋型黑曲霉脂肪酶。4 個(gè)重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢式酵母GS115 菌株進(jìn)行異源表達(dá)后，僅pPC19K-anl-D99P和pPC19K-anl-K108E 實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。李堂等[18]研究脂肪酶催化菜籽油乙醇解反應(yīng)的幾個(gè)主要影響因素的結(jié)果表明，采用正己烷作溶劑，能有效增加反應(yīng)體系中乙醇與菜籽油的互溶性，使反應(yīng)物充分接觸，有效降低乙醇的局部濃度，減小其對(duì)酶的毒害作用，消除酶的團(tuán)聚現(xiàn)象，改善脂肪酶所處微環(huán)境。

 

 

 

 

2.3 全細(xì)胞法

 

 

 

酶法生產(chǎn)生物柴油進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用的最大障礙是脂肪酶的成本太高，一個(gè)很有前景的解決方法是以全細(xì)胞生物催化劑的形式利用脂肪酶[19]。清華大學(xué)的曾靜等[20]利用霉菌R. oryzae IFO 細(xì)胞催化植物油脂與甲醇醇解反應(yīng)合成生物柴油，通過(guò)探究培養(yǎng)過(guò)程中各項(xiàng)參數(shù)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)以及該細(xì)胞催化劑對(duì)醇解反應(yīng)活性的影響，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的催化活性隨細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加油脂的不同而變化。在優(yōu)化的操作參數(shù)（大豆精制油20 g/L，蛋白胨70 g/L，NaNO3 1.2 g/L，KH2PO4 1.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，培養(yǎng)溫度35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速130 r/min）下培養(yǎng)得到的細(xì)胞催化劑能有效催化大豆油與甲醇三步轉(zhuǎn)化酯化反應(yīng)生成生物柴油，最終得率可達(dá)86%。

 

 

 

3 結(jié)語(yǔ)